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Ziel der Arbeit
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2.1 Material
- 2.1.1 Chemikalien und Enzyme
- 2.1.2 Lösungen
- 2.1.3 Medien
- 2.1.4 Biologisches Material
- 2.1.5 cDNA-Populationen
- 2.1.6 Bakterien
- 2.1.7 Größenstandards
- 2.1.8 Analysesoftware
2.2 Methoden
- 2.2.1 Suppression Subtractive Hybridization (SSH)
- 2.2.1.1 Reinigung von cDNA über Säulenchromatographie
- 2.2.1.2 Restriktionsverdau und Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
- 2.2.1.3 NucleoTrap® -Aufreinigung
- 2.2.1.4 Adapter-Herstellung
- 2.2.1.5 Subtraktive Hybridisierung
- 2.2.2 DNA-Auftrennung mit Agarose-Gelelektrophorese
- 2.2.3 Klonierung und Transformation der PCR-Fragmente
- 2.2.4 Kolonie-PCR
- 2.2.5 Mini-Präparation von Plasmid-DNA und Dauerkultur-Platten
- 2.2.6 Southern-Transfer (Transfer von DNA auf Membrane)
- 2.2.7 Herstellung von radioaktiv markierten Sonden
- 2.2.8 Bestimmung der spezifischen Aktivität
- 2.2.9 Radioaktive Nachweismethode
- 2.2.10 Quantitative Auswertung radioaktiver Signale
- 2.2.11 Konzentrationbestimmung von DNA
- 2.2.12 DNA-Sequenzierung
- 2.2.13 Sequenzanalyse
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3.1 Vorbereitung der cDNA zur Suppression Subtractive Hybridization (SSH)
- 3.1.1 Säulenaufreinigung der cDNA
- 3.1.2 Präparativer RsaI-Verdau der aufgereinigten cDNA
- 3.1.3 NucleoTrap® -Aufreinigung der verdauten cDNA-Fragmente
3.2 SSH-Suppression Subtractive Hybridization
- 3.2.1 Ligation der Adaptoren an die cDNA-Fragmente
- 3.2.2 Subtraktive Hybridisierung der cDNA-Populationen und
Amplifikation (der entstandenen Fragmente)
3.3 Klonierung und Transformation der durch SSH
erhaltenen cDNA-Fragmente
3.4 Southern-Blot-Analyse der durch SSH erhaltenen cDNA-Fragmente
- 3.4.1 Southern-Blot-Analyse
- 3.4.2 Quantitative Auswertung der Southern-Blots
3.5 Sequenzanalysen
3.6 Zusammenfassung der erhaltenen Daten
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- 4.1 Verwendung der SSH zur Isolierung differentiell exprimierter
Fragmente aus cDNA von Samenanlagen vor und
nach Befruchtung
- 4.2 Quantitative Auswertung der durch SSH isolierten cDNA-Fragmente
- 4.3 Datenbankrecherchen nach Homologien zu bekannten Genen und ESTs
- 4.4 Putativ befruchtungsinduzierte Gene
- 4.5 Schlußfolgerung und Ausblick
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6 Abkürzungsverzeichnis
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Anhang
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